2. Mercaptoetanol: 1 x 1,0mL

. Placa de Microtitulação Fundo V: 1 Unidade

. Flanela: 1 Unidade

5 - Reagentes

Composição:

. Hemácias Sensibilizadas: Hemácias de Ave a 1% em tampão PBS, sensibilizadas com antígeno de Toxoplasma gondii purificado. Antes do uso deve ser corretamente homogeneizado. Com esse objetivo, pegue o frasco e agite girando-o entre as palmas das mãos até que o sedimento esteja totalmente em suspensão.

. Diluente da Amostra: Solução tampão pH 7,2. Composição: cloreto de sódio (NaCI) 0,15mol/L, fosfato de potássio monobásico (KH2P04) 0,0019mol/L, fosfato de sódio de básico (Na2HPO4) 0,0047mol/L, azida de sódio (NaN3) 0,015mol/L e cromógeno.

. Controle Positivo IgG: Soro equino positivo para Toxoplasmose. Pronto para uso.

. Controle Poistivo IgM: Soro equino IgM positivo para Toxoplasmose. Pronto para uso.

. Controle Negativo: Soro equino negativo para Toxoplasmose. Pronto para uso.

6 - Armazenamento e Estabilidade

. Hemácias Sensibilizadas: O congelamento do antígeno provoca a sua auto-aglutinação inutilizando-o defenitivamente. Pode ocorrer o desligamento hemácias/antígeno se houver repetidas mudanças de temperatura (geladeira/temperatura ambiente).

(Todos reagentes contidos no Bio-Toxo são estáveis até a data registrada no rótulo quando conservados entre 2 a 8ºC)

7 - Recomendações

É necessário inativar o soro. Com esse objetivo, aliquotar 200uL em um tubo e mantê-lo 30 minutos em banho maria a 56ºC;

Não se deve usar plasma;

As placas devem ficar em repouso em local livre de vibrações;

Placas reutilizadas com resíduos de detergentes interferem no resultado;

Todas as amostras devem ser manipuladas como material potencialmente infectante;

Resultados confiáveis dependem da observância de todas as etapas do método;

A variação para mais ou menos de 1 título em um mesmo espécime é desprezível na técnica de titulação;

A azida de sódio é utilizada como conservante do DILUENTE DA AMOSTRA e dos Controles (POSITIVO e NEGATIVO). Ela pode reagir com chumbo ou cobre, formando azidas metálicas que são explosivas. Ao descartar reagentes que contenham azida de sódio, deve-se descartar sobre um grande volume de água corrente para evitar acúmulo de azida na pia.

Deixar os reagentes atingir a temperatura ambiente antes de sua utilização.

Evitar o contato de qualquer reagente com a pele e não pipetar com a boca.

8 - Materiais Necessários

. Pipeta de vidro de 1mL 1:100

. Pipeta de precisão para medir 25uL

. Pipeta de precisão para medir 50uL

. Tubos de ensaio

. Estante para tubos de ensaio

. Agitador para placas (opcional)

. Banho maria 56ºC

9 - Protocolo

A) Inativar uma alíquota da amostra (200uL), inclubando-a por 30 minutos a 56ºC;

Fazer uma diluição a 1/32 da amostra e dos soros controles (Positivo IgG e Negativo). Recomendamos utilizar 800uL (0,8mL) de DILUENTE DA AMOSTRA e 25uL do SORO inativo. Não inativar os controles, pois os mesmos já encontram-se inativados e pronto para uso;

Umedecer a flanela fornecida no kit e colocar a placa de microtitulação sobre a mesma, para inativar as forças eletrostáticas;

Transferir 50uL da Diluição para as respectivas cavidades da placa;

Pipetar 25uL de HEMÁCIAS SENSIBILIZADAS em cada orifício que contenha a diluição. Homogeneizar em agitador de placas ou com leves batidas na lateral da placa;

Deixar em repouso sobre a flanela úmida em local livre de vibrações por 1 a 2 horas;

Proceder à leitura da reação.

B) Semi-Quantitativo

Quando o teste de triagem resultar positivo, proceder a titulação.

Em 6 orifícios da placa, pipetar 50uL de DILUENTE DA AMOSTRA;

Ao primeiro orifício pipetar 50uL da amostra diluída 1/32 que sobrou do teste qualitativo. Homogeneizar com a micropipeta e transferir 50uL para o orifício seguinte, assim sucessivamente até o último orifício que contenha o diluente da amostra.

Pipetar 25uL de HEMÁCIAS SENSIBILIZADAS em cada orifício que contenha a diluição. Homogeneizar em agitador de placas ou com leves batidas na lateral da placa;

Deixar em repouso sobre a flanela úmida em local livre de vibrações por 1 a 2 horas;

Proceder à leitura da reação.

c) Protocolo para Pesquisa de Anticorpos da Classe IgM

Preparo da Solução de 2-ME a 0,2M.

- Diluente da amostra - 10,0mL

- 2-Mercaptoetanol P.A. - 0,14mL

Estável por 30 dias ao abrigo da luz e sob refrigeração.

TRATAR O SORO COM 2-ME a 0,2M

- Soro - 0,05mL

- Diluente da amostra - 0,15mL

- Solução de 2-ME a 0,2M

Homogeneizar e deixar em repouso por 60 minutos a 37ºC.

Esta diluição corresponde a 1:8

Proceder a novo teste colocando em uma placa de fundo em V, em cada orifício, 50uL de DILUENTE DA AMOSTRA. Ao primeiro orifício colocar 50uL da AMOSTRA (SORO) tratada com 2-ME, homogeneizar com a micropipeta e transferir 50uL para o orifício seguinte, assim sucessivamente até o último orifício desejado. (Os títulos neste caso são 1/16, 1/32, 1/64,...).

Colocar em cada orifício 25uL de HEMÁCIAS SENSIBILIZADAS. Seguir os procedimentos do teste semi-quantitativo (homogeneizar, repousar, ler etc).

10 - Leitura

REAÇÃO POSITIVA

Formação de película (véu) que cobre todo o fundo do pocinho. Amostra fracamente positiva apresenta formação de véu e formação de botão (hemaglutinação incompleta).

REAÇÃO NEGATIVA

Botão de hemácias sedimentadas no fundo do poço.

Ausência de véu.

TÍTULO DA AMOSTRA

Maior diluição que apresenta resultado positivo ou fracamente positivo.

11 - Interpretação

Reação negativa no teste com soro não tratdo e no teste com soro tratado indicam que o paciente ainda não teve contato com Toxoplasma gondii. Em casos suspeitos de infecção recente deve-se repetir o teste com intervalo de 15 dias.

Reações com títulos elevados em ambos os testes indicam a presença de anticorpos da classe IgG.

Reações com títulos elevados no teste do soro não tratados e com redução de dois ou mais títulos no soro tratado com 2-Mercaptoetanol indicam a presença de anticorpos da classe IgM.

Caso os títulos sejam baixos e o soro tratado negativar, descarta-se a presença de anticorpos inespecíficos, repetindo o teste com nova amostra 15 dias após.

ATENÇÃO: As provas sorológicas devem sempre ser confirmadas por outra metodologia.

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