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Metodologia
direta para dosagem HDL e LDL pelo Princípio de Clearance |
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Para o acompanhamento do tratamento das duas dislipidemias mais freqüentes, elevação do triglicérides e redução de colesterol HDL, o NCEP recomenda a utilização do colesterol LDL como o principal marcador, como segunda opção, sugere a monitoração do colesterol não-LDL. Diante destas recomendações, torna-se muito importante a padronização de métodos para dosagem de HDL e LDL com altos níveis de precisão e exatidão. O próprio NCEP estabelece como meta valores de CV e bias inferiores a 4% para cada uma das dosagens do perfil lipídico. Para as dosagens de Triglicérides e colesterol total os métodos de referência são os enzimáticos, padronizados internacionalmente e certificados por todos os programas de controle de qualidade. Para a fração HDL
do colesterol verificamos uma evolução de metodologias na última década.
O método de referência, utilizado pelo CDC RM, para este parâmetro é
a ultracentrifugação que, embora utilizada em laboratórios de
pesquisa e na validação de outros métodos é impraticável na rotina
laboratorial devido às características operacionais. Outros métodos,
tais como eletroforese e HPLC, também encontram dificuldades
operacionais para a sua padronização na rotina de laboratórios de análises
clínicas. As metodologias aplicáveis à rotina laboratorial são classificadas em três gerações. Na primeira geração encontramos as metodologias baseadas na precipitação seletiva por reagentes químicos. Na primeira etapa do método ocorre a precipitação das lipoproteínas não-LDL e a separação das lipoproteínas HDL por centrifugação, na segunda etapa a dosagem do colesterol no sobrenadante. Este método é ainda amplamente utilizado, porém apresenta várias fontes de erros e não se insere adequadamente na rotina de laboratórios automatizados, ficando restrito à técnicas manuais. O método de segunda geração utiliza um processo de separação magnética d HDL, evitando o processo de centrifugação. Entretanto, este método encontrou pouca aplicação em laboratórios clínicos. Os métodos de terceira geração representam um grande avanço, pois possibilitam a automação da dosagem do HDL e permitem a quantificação sem a etapa de precipitação. São metodologias que utilizam técnicas com dois reagentes, sendo a segunda etapa uma reação enzimática-colorimétrica. As várias metodologias diferem no primeiro reagente e podemos identificar dois princípios distintos: MASCARAMENTO e CLEARANCE. No princípio de MASCARAMENTO utiliza-se como primeiro reagente anticorpos específicos ou polímeros combinados com detergentes que impedem a ação colesterol oxidase e colesterol esterase sobre a fração não-HDL do colesterol, ocorrendo a reação enzimática apenas com o colesterol HDL (fig. 1).
No princípio de CLEARANCE, adotado no kit RANDOX, o primeiro reagente, além das enzimas colesterol oxidase e colesterol esterase, estão presentes substâncias que protegem o colesterol HDL destas enzimas, sendo na primeira etapa da reação degradado todo o colesterol LDL, HDL e quilomícrons. No segundo reagente estão presentes substâncias que liberam o colesterol HDL para a reação enzimática-colorimétrica (fig. 2).
O Princípio de clearance permite eliminar de forma muito eficaz as lipoproteínas não-HDL tornando o método aplicável mesmo frente a altas concentrações de triglicérides (até 1400 mg/dL). Para a avaliação desta eficiência foi utilizado um método cromatográfico para a separação das frações do colesterol em amostras primárias e após o tratamento com o reagente (1). O resultado, apresentado na figura (3), revela que praticamente toda a Lipoproteína não-HDL foi eliminada da amostra.
A comparação do kit RANDOX com o método de referência de CDC RM, resultou na equação de regressão y = 0,979x + 1,13 com R = 0,99; atestando a grande correlação entre os métodos (fig. 4).
A grande eficiência na etapa de eliminação das lipoproteínas não-HDL, a não interferência de triglicérides até uma concentração de 1400 mg/dL, a forte correlação com o método de referência do CDC e cumprimento das exigências do NCEP conferem ao usuário do kit RANDOX a segurança de um resultado de alta precisão e exatidão. Para a fração LDL as exigências de precisão e exatidão do NCEP são as mesmas adotadas para o HDL (CV e bias < 4%) e tendo em vista a importância que a dosagem do colesterol LDL assume como marcador de preferência para o acompanhamento das dislipidemias, torna-se necessário realizar a dosagem de LDL com métodos cada vez mais precisos. A
forma de determinação do LDL mais utilizada pelos laboratórios clínicos
é a equação de Friedewald. Esta equação, apesar de fornecer
resultados aceitáveis, apresenta uma série de limitações que
dificultam sua aplicação: (1) necessidade de jejum de 12 horas; (2) não
aplicável à pacientes com alimentação parenteral; (3) concentrações
de triglicérides < 400 mg/dL; (4) ausência de b-VLDL;
(5) maior CV em estatísticas interlaboratoriais. Além desses, devemos
considerar que a propagação dos erros inerentes a dosagem de cada parâmetro
da equação, gerando um erro maior no valor calculado de LDL. Estas sérias
limitações justificaram o desenvolvimento de metodologias para a dosagem
de LDL. Na primeira geração de metodologias, encontramos a precipitação seletiva. Na segunda geração encontram-se os métodos de imuno-separação. A terceira geração compreende os métodos diretos, utilizando princípios similares aos utilizados na dosagem do HDL, MASCARAMENTO e CLEARANCE. O kit LDL COLESTEROL, fabricado pela RANDOX, baseia-se no princípio CLEARANCE e apresenta características de desempenho similares às verificadas para o HDL COLESTEROL. Na primeira etapa da reação, todo o colesterol não-LDL é consumido por reações enzimáticas, sendo o LDL colesterol protegido da ação das enzimas por substâncias específicas. Foi realizada um experimento para avaliação da eficiência da eliminação das lipoproteínas não-LDL nesta etapa da reação utilizando um processo de separação por cromatografia aplicado a amostras de soro antes e depois desta etapa da reação. O gráfico dos resultados, apresentado na Fig. 5, revela uma alta eficiência na eliminação seletiva do colesterol não-LDL.
Na segunda reação, o LDL colesterol é dosado através de um método enzimática-colorimétrico (fig. 6).
A comparação do kit LDL COLESTEROL RANDOX, com o método de referência do CDC RM, forneceu a equação de regressão y = 1,0435x – 6,5664; com R = 0,99. Resultados que atestam a excelente correlação entre os métodos (fig. 7).
Numa segunda avaliação de performance do kit LDL COLESTEROL RANDOX, foram selecionadas amostras com valores de triglicérides superior a 815 mg/dL e comparados os resultados com o kit RANDOX e o método de referência do CDC RM. Os resultados, apresentados na fig. 8, revelam uma excelente correspondência entre os valores nesta situação crítica. A equação obtida foi y = 0,926x + 13,2; com R = 0,98. Na avaliação de substância interferentes, foi verificado que uma concentração de triglicérides de até 1200 mg/dL não interfere no método.
A combinação destas características de performance com a facilidade de automação do método de dosagem direta, conferem ao kit LDL COLESTEROL RANDOX a segurança e praticidade necessárias à rotina laboratorial. (REFERÊNCIAS:Warnick,
G.R.; Matthias, N.; Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of
HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clin.
Chem 2001(47):1579-1594. Warnick,
G.R.; Matthias, N.; Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of
LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous
Assays versus Calculation. Clin. Chem 2001(47):1579-1594. |
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